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科研实验 关于钙离子荧光探针你真的了解吗

钙离子荧光探针常见问题解答

自从Fluo-3、Fluo-4问世以来,钙离子的检测便活跃在大量的实验研究之中,随着实验的需求增加,钙离子检测探针也一次又一次的研发出荧光强度更好、背景更低的一系列物美价廉的产品。市场常见的钙离子检测试剂:Fluo-3Fluo-4Rhod-2Rhod-4Fluo-8cal-520Calbryte-520等。由于目前市场上钙离子检测试剂的五花八门,有些同学就有些慌了,到底哪个试剂才是最适合我实验的选择呢?请跟着百萤一起看看吧!



钙离子荧光探针选择建议:

  • 根据荧光颜色、荧光强度、背景这些会影响实验过程中的观察、操作的因素来选择更适合自己实验的探针。

  • 根据自己实验室现有仪器来选择适合自己实验的探针。


单波长荧光探针 (根据荧光强度越强,背景越低依次排列)

 绿色荧光 深红色荧光 红色荧光
Fluo-3Cal-630Rhod-2
Fluo-4 Calbryte 630(不需要丙磺舒)Rhod-4
Fluo-8
Cal-590 
Cal-520
Calbryte 590(不需要丙磺舒)
Calbryte 520(不需要丙磺舒)

 

图示: CHO-K1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 将CHO-K1细胞以每孔100μL每孔40,000个细胞接种过夜,在96孔黑色壁/透明底板中。将含有丙磺舒的HHBS中的100μLFluo-4AM或Calbryte 520AM加入孔中,并将细胞在37℃下孵育45分钟。 用200μLHHBS替换染料加载培养基,加入50μL50μMATP,并使用FITC通道用荧光显微镜(Keyence)成像。


双波长比率荧光探针

适用于流式适用于成像
Indo-1Fura-2

Fura-8(Fura-2升级版,S/N更高)
Cal Red R525/650 AM(相比Fura-2与Indo-1,它非紫外激发,细胞损伤小)

 

常见问题解答

1.丙磺舒(probenecid)被报道会影响钙离子通道,比如干扰环核苷酸门控通道,有没有可以不用该试剂的钙离子探针?



回答:

丙磺舒(probenecid),是一种阳离子转运体抑制剂,用来降低探针进入胞内后被排除的几率,以提高胞内信号。常见的Fluo-3 、fluo-4、 Fluo-8都需要丙磺舒,否则信号会很低。您可以选择Calbryte系列,该系列无需丙磺舒(probenecid)仍会有很好的信号,降低干扰,是不含丙磺舒(probenecid)产品的最佳选择。

     

图示:在存在丙磺舒(左)和不存在(右)的情况下进行Ca2+检测测定,并使用Ex / Em = 540/590的FlexStation3测量了截止波长为570 nm的响应。


2.没有动态读数功能或者没有自加样功能的酶标仪还能做钙流检测吗?



回答:

可以。钙流检测的仪器常见的有FlexStation, FLIPR等,可以连续读数并带有自加样系统,这样就可以在秒的时间范围内捕捉到更完整的钙离子浓度变化。但如果实验室实在用不到这样的机器,可以考虑Cell Meter 钙检测免洗和免丙磺舒检测试剂盒 (Cat# 36312),使用普通的底读酶标仪就可以了。该试剂盒使用了Fluo-8E AM探针,一旦与钙离子结合,信号增>100倍,能够使信号维持1-2min左右,给我们自己手动加样争取时间。


3.流式检测钙离子因为要取下管子加刺激剂,容易错过最高峰,有没有办法?



回答:

我们有流式检测钙离子试剂盒,Cat#36310,Cell Meter 钙测定流式细胞分析试剂盒,也可以选择Fluo-8H AM探针,因Kd比较小,可以使信号保留的时间久一些。


4.有检测植物细胞的钙离子探针吗?



回答:

有的。常用的 Fluo-4 AMFluo-8 AM 以及 Calbryte 520 AM, 都适用于植物细胞,Fluo-4最常用,若要获得更好的信噪比,推荐其升级版本 Calbryte 520 AM。


5.内质网(ER)或者线粒体内的钙离子浓度变化,分别使用什么探针?



回答:

ER钙离子检测可使用Kd 较高的Rhod-5N, AM (Cat# 21070). 线粒体钙离子检测可使用 Rhod-2 AM (Cat# 21064)。Rhod-2 在低浓度时特异识别线粒体。


6.血液等体液的里的钙离子浓度用什么检测方法?



回答:

人体血液里钙离子的浓度大约在19 -10.5 mg/dL范围内。血液里钙离子浓度过低或者过高可引起低钙血症和高钙血症 。 Amplite 荧光法钙离子定量试剂盒(Cat#36360)可用于定量体液的钙离子浓度,可使用96孔或者384孔板经酶标仪独取数值。不需样本分离直接检测,30min可完成,最低检测0.03mM的钙离子。


7.荧光探针的AM、Dextran葡聚糖形式有什么区别?



回答:

AM 形式通过孵育即可进入细胞内,简便。若检测孵育时间久容易发生区室化,比如钻进了内质网等亚器官内。 Dextran最大的优势就是降低了区室化作用,但是需要介入方式进入细胞内,比如microinject等。


8.我们需要高通量检测,选择什么产品?



回答:下列产品免洗,无需去除培养基,加入染料孵育,直接加刺激剂即可检测。适用于高通量。

品牌产品名称货号AATCell Meter 钙检测免洗和免丙磺舒检测试剂盒Cat#36312AATScreen Quest 免洗Fluo-8钙检测试剂盒Cat#36315AATScreen Quest 免洗Fura-2钙检测试剂盒Cat#36320AATScreen Quest 免洗Fluo-4钙检测试剂盒Cat#36325AATScreen Quest Calbryte 590 免丙磺舒和免洗钙检测试剂盒Cat#36201AATCell Meter 钙检测免洗和免丙磺舒检测试剂盒Cat#36312AATScreen Quest Calbryte 520 免丙磺舒和免洗钙检测试剂盒Cat#36318


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